בפרעות שבוצעו ביהודי העיר ב-1592 נבזזו והושחתו חנויות ובתים, ובית הכנסת נשרף. היהודים תבעו את הפורעים בבית הדין של המלך, והמשפט הסתיים בפשרה. שנה לאחר מכן כבר קיבלו יהודי וילנה מהמלך זיגמונט השלישי כתב זכויות חדש, במסגרתו הורשו לעסוק במסחר ובמלאכה, לקיים חיי דת ולהקים מקווה טהרה, בית עלמין ואטליזים לממכר בשר כשר. הרב קיבל אוטונומיה שיפוטית בסכסוכים פנימיים. במסגרת כתב הזכויות התאפשר ליהודים להקים מחדש את בית הכנסת, והפעם בנו אותו מלבני בניין, בסגנון מערב אירופי.
בתחילת המאה ה-17 התיישבו בווילנה יהודים מערי פולין, מפראג ומפרנקפורט שעל נהר המיין, ביניהם בעלי ממון, תלמידי חכמים, סוחרים זעירים ובעלי מלאכה. חמישית מ-15,000 התושבים בעיר בתקופה זו היו יהודים, והם נהנו מזכויות יתר בתחום המסחר והמלאכה, מפטור כמעט מלא ממסים ומהזכות להשתמש במערכות המים והמשקל העירוניות.
באמצע המאה ה-17 עמדה קהילת יהודי וילנה בראש גליל, חבל ארץ, ו"קהילות סביבה" היו כפופות לה מבחינת מיסוי ושיפוט. מעמד הקהילה נפגע קשות עקב פלישת חיילי הצאר אלכסיי, בעלי בריתו של בוגדן חמיילניצקי שמרד בפולנים. הרובע היהודי נשרף ורוב יהודי העיר נמלטו ממנה. אלה שלא נמלטו – נרצחו. קשרי המסחר של יהודי וילנה עם קהילות רבות נותקו, ועקב כך נפגעה כלכלתם קשות. כאשר שב השלטון בווילנה לידי שליטי ממלכת פולין-ליטא, שבו היהודים וקיבלו בחזרה חלק מזכויותיהם.
בתחילת המאה ה-18 נפגעו היהודים על ידי תושבי העיר הנוצריים וכן עקב מלחמות הרוסים והשוודים. בעקבות המלחמות פרצו מגפות ורעב, דליקות החריבו רבעים שלמים בווילנה ויהודי העיר נקלעו לחובות. בלחצם של הסוחרים ובעלי המלאכה הנוצרים שוב הוטלו עליהם הגבלות. בסוף המאה ה-18 הושב ליהודים חופש המסחר והמלאכה, בוטלו רוב ההגבלות על מגוריהם בעיר והם הושוו לנוצרים מבחינת תשלומי המסים.
בסוף המאה ה-18 תמכו רוב יהודי העיר במרד הפולני בראשות קושצ'יושקו, אך עם חלוקת פולין סופחה וילנה עם האזור כולו לקיסרות הרוסית.
